中藥材及飲片的準(zhǔn)確鑒定是中藥監(jiān)管的重要問(wèn)題和環(huán)節(jié)，是用藥安全的關(guān)鍵。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）共收載中藥材及飲片616種，其中多基原藥材占近1/4。受物種延續(xù)性、變異性和復(fù)雜性等因素的影響，中藥材品種混亂、基原復(fù)雜以及同名異物或同物異名等現(xiàn)象普遍存在，給中藥監(jiān)管帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。全國(guó)市場(chǎng)質(zhì)量抽檢數(shù)據(jù)顯示，2013—2020年，我國(guó)中藥材及飲片總體合格率分別為64%、68%、75%、77%、84%、88%、91%、96%，表明系列監(jiān)管措施和現(xiàn)代檢驗(yàn)科學(xué)技術(shù)的運(yùn)用促使中藥材及飲片合格率呈穩(wěn)步向好趨勢(shì)，但混偽品冒充正品或摻偽等問(wèn)題仍較為突出。2021年國(guó)家藥監(jiān)局組織開(kāi)展的中藥飲片專(zhuān)項(xiàng)抽檢及中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，混偽品代用、摻雜問(wèn)題依舊存在，如藏柴胡冒充柴胡、關(guān)蒼術(shù)及雜交蒼術(shù)摻偽冒充蒼術(shù)、莧菜子摻偽青葙子等提示對(duì)這些問(wèn)題仍須高度關(guān)注。

準(zhǔn)確可靠的鑒定方法對(duì)保障中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展起著舉足輕重的作用。傳統(tǒng)中藥鑒定方法往往依賴(lài)中藥形態(tài)特征及化學(xué)特征，易受多種因素影響，難以從根本上解決鑒別準(zhǔn)確性的問(wèn)題。DNA條形碼技術(shù)作為經(jīng)典鑒定手段的延伸，是利用生物體DNA中一段保守片段，對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)，相比傳統(tǒng)方法具有更好的通用性、重復(fù)性和可比性，是現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和監(jiān)管中的重要組成部分。

中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

物種差異歸根結(jié)底是基因型差異，DNA如“身份證”一樣具有唯一性。DNA條形碼技術(shù)利用標(biāo)準(zhǔn)基因片段對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確識(shí)別與鑒定，具有通用性，能夠用來(lái)區(qū)分不同物種。中藥材DNA條形碼技術(shù)的廣泛應(yīng)用需要存儲(chǔ)海量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)作支撐。

在藥用植物DNA條形碼序列篩選中，研究團(tuán)隊(duì)從葉綠體基因組、線(xiàn)粒體基因組和細(xì)胞核基因組三個(gè)部分進(jìn)行了篩選和對(duì)比，提出將核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）分為3段。其中，長(zhǎng)度約為230bp的ITS2序列提取測(cè)序較容易，物種鑒定能力更強(qiáng)，更加適合用于對(duì)中藥材等存在DNA降解材料的鑒定，且鑒定效率顯著優(yōu)于國(guó)際生物條形碼協(xié)會(huì)植物工作組推薦的序列組合。研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次提出將ITS2序列作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，同時(shí)建議將ITS2作為新的通用條形碼用于鑒定更廣泛的植物類(lèi)群，實(shí)現(xiàn)了從跟隨國(guó)際研究到引領(lǐng)國(guó)際研究的華麗轉(zhuǎn)身。“ITS2作為藥用植物通用DNA條形碼研究”“中草藥DNA條形碼鑒定”等科研論文在一系列國(guó)際權(quán)威SCI雜志發(fā)表后，引發(fā)了國(guó)際社會(huì)對(duì)ITS2序列研究的關(guān)注。

經(jīng)過(guò)10余年持續(xù)研究，研究團(tuán)隊(duì)建立了全球最大的中草藥DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)和藥用植物DNA條形碼鑒定網(wǎng)站（htt p:// www.gpgenome.com/blast）。該數(shù)據(jù)庫(kù)收載了2萬(wàn)余個(gè)物種，除了《中國(guó)藥典》收載的藥材及4.8余萬(wàn)份混偽品樣品外，還涵蓋美國(guó)草藥典、日本藥局方、歐洲藥典、韓國(guó)藥典和印度藥典收載的絕大多數(shù)植物藥。

中藥材DNA條形碼鑒定體系構(gòu)建及應(yīng)用

基于ITS2作為中藥通用DNA條形碼序列的研究，研究團(tuán)隊(duì)從中藥材鑒定體系構(gòu)成、標(biāo)準(zhǔn)操作流程建立、中草藥物種鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)建設(shè)、鑒定軟件系統(tǒng)開(kāi)發(fā)等多方面，創(chuàng)建了包括以ITS2序列為核心、psbA-trnH為補(bǔ)充序列的植物類(lèi)藥材DNA條形碼，以及以COI序列為核心、I TS2為輔助序列的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼的中藥材DNA條形碼鑒定體系，為中草藥建立了“基因身份證”。實(shí)現(xiàn)了利用中草藥“基因身份證”的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定，開(kāi)發(fā)了具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥高通量DNA條形碼鑒定一體機(jī)。同時(shí)，該技術(shù)體系可實(shí)現(xiàn)對(duì)中國(guó)、美國(guó)、日本、歐洲、韓國(guó)和印度等國(guó)家和地區(qū)藥典收載的草藥進(jìn)行DNA條形碼物種鑒定。2017年3月，在由中國(guó)科學(xué)報(bào)社、人民網(wǎng)等單位共同主辦的“2016中國(guó)十大醫(yī)學(xué)進(jìn)展/新聞人物”評(píng)選活動(dòng)頒獎(jiǎng)典禮上，該成果被評(píng)選為“2016 年中國(guó)十大醫(yī)學(xué)進(jìn)展”。此外，該成果還榮獲2016年度國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)；被世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)（WFCMS）評(píng)價(jià)為“標(biāo)志著中藥進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)化的基因鑒定時(shí)代”；2017年，《自然》雜志專(zhuān)刊評(píng)述該體系“開(kāi)辟了中草藥鑒定新篇章”。

“中藥材DNA條形碼分子鑒定法”作為指導(dǎo)原則已被納入《中國(guó)藥典》，鑒定體系也已被國(guó)內(nèi)外眾多檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、科研院所、高校、藥材生產(chǎn)及流通企業(yè)、醫(yī)院等應(yīng)用。大量應(yīng)用實(shí)踐表明，該技術(shù)體系從基因?qū)用嬗行Ы鉀Q了傳統(tǒng)中草藥千百年來(lái)物種真?zhèn)舞b定的難題，可廣泛用于中藥材源頭加工、生產(chǎn)、流通、研究等各個(gè)環(huán)節(jié)，為中藥材鑒定提供全方位保障，從而服務(wù)中藥監(jiān)管，助力產(chǎn)業(yè)品質(zhì)提升。

基于DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列的快速鑒定方法研究及應(yīng)用

中藥材的生產(chǎn)及流通處于產(chǎn)業(yè)鏈前端，是最需要中藥鑒定技術(shù)的環(huán)節(jié)。將中藥DNA條形碼鑒定技術(shù)與核酸現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)技術(shù)交叉融合，以適應(yīng)中藥材現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定的不同場(chǎng)景，已成為必要。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將DNA條形碼技術(shù)與等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)、側(cè)向流檢測(cè)試紙（LFD）裝置相結(jié)合，成功研發(fā)出一種快速鑒定劇毒植物鉤吻的方法。該方法易于執(zhí)行且不需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備，可在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生可靠結(jié)果，適用于鉤吻的現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定。

此外，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地利用多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增技術(shù)、核糖核酸酶H依賴(lài)性PCR結(jié)合熔解曲線(xiàn)，根據(jù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列中穩(wěn)定的變異位點(diǎn)，建立了針對(duì)蒼術(shù)、菟絲子、石菖蒲、人參、黨參、半夏、薄荷、麥冬等近30種中藥材的摻雜鑒定方法，拓寬了DNA條形碼分子鑒定技術(shù)的使用范圍。目前已將其應(yīng)用到國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)非標(biāo)方法研究及中藥材補(bǔ)充檢驗(yàn)方法建立研究中，為快速現(xiàn)場(chǎng)鑒定提供了新思路，推動(dòng)形成涵蓋現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的中藥DNA條形碼快速鑒定模式。

由于DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定方面效果顯著，目前已廣泛應(yīng)用于植物快速準(zhǔn)確鑒定。事實(shí)上，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)植物DNA條形碼近緣物種分辨率有限的問(wèn)題，早在2008年加拿大植物無(wú)國(guó)界（Botany without Borders）會(huì)議上，就有學(xué)者提出超級(jí)條形碼（ultrabarcoding）的概念，認(rèn)為葉綠體全基因組序列包含的信息量與動(dòng)物線(xiàn)粒體COI基因序列相當(dāng)，應(yīng)該可以將葉綠體基因組的整個(gè)序列作為條形碼使用。

近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)步。研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造性地將“本草基因組學(xué)”這一概念和理論引入中藥材鑒定領(lǐng)域，在針對(duì)疑難品種的條形碼鑒定研究中，重點(diǎn)采用葉綠體全基因組序列開(kāi)展物種鑒定。研究團(tuán)隊(duì)建立了中草藥單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)用于葉綠體基因組測(cè)序，利用該技術(shù)可以快速獲得大量用于“超級(jí)條形碼”（super-barcode）鑒定的葉綠體基因組序列。通過(guò)多序列比對(duì)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)薯蕷屬葉綠體基因組中基因間隔區(qū)以及非編碼區(qū)變異率高于保守的蛋白編碼區(qū)域，LSC區(qū)、SSC區(qū)變異率大于IR區(qū)，并篩選出了10個(gè)潛在的適合用于鑒定薯蕷屬植物的特異性DNA條形碼序列，其中包括5個(gè)蛋白編碼基因和5個(gè)基因間隔區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，葉綠體全基因組序列可作為薯蕷屬物種鑒定的“超級(jí)條形碼”，為薯蕷屬系統(tǒng)進(jìn)化以及物種鑒定等領(lǐng)域研究提供依據(jù)。

研究團(tuán)隊(duì)在考察大樣本量不同常用DNA 條形碼序列組合的鑒定能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，常用分子標(biāo)記對(duì)典型多基原藥材大黃的鑒定效率均不足70%。葉綠體基因組作為植物鑒定的“超級(jí)條形碼”，在物種鑒定中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究團(tuán)隊(duì)利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得大黃藥材基原物種掌葉大黃、藥用大黃及唐古特大黃的葉綠體基因組，并基于“超級(jí)條形碼”開(kāi)發(fā)得到“特異條形碼”，有效解決了大黃藥材基原鑒定問(wèn)題。同時(shí)，該成果在大黃配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)研究制定過(guò)程中起到積極作用。另外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)采用貝母屬10個(gè)物種26個(gè)樣本的葉綠體基因組序列，也驗(yàn)證了“超級(jí)條形碼”對(duì)近緣物種準(zhǔn)確鑒定的有效性。

值得關(guān)注的是，受限于應(yīng)用成本以及數(shù)據(jù)分析所需服務(wù)器設(shè)施等因素，“超級(jí)條形碼”目前尚不能如 DNA條形碼一樣廣泛推廣。因此，研究團(tuán)隊(duì)為解決DNA條形碼目前難以鑒定近緣物種的困境，針對(duì)既定植物類(lèi)群，在葉綠體基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上篩選得到“特異條形碼”。該條形碼結(jié)合了單位點(diǎn)條形碼鑒定速度快、“超級(jí)條形碼”變異位點(diǎn)多的優(yōu)勢(shì)，可有效應(yīng)用于種及種下分類(lèi)等級(jí)植物鑒定。

隨著現(xiàn)代雜交育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用，中藥材雜交品種成為可能。種質(zhì)是中藥材品質(zhì)安全、有效和質(zhì)量可控的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同物種之間雜交產(chǎn)生的雜交品種，雖然性狀等鑒別特征與親本差別微小，但由于化學(xué)成分很可能發(fā)生了改變，其是否能夠作為中藥材使用、臨床功效是否受到影響等藥品安全有效性問(wèn)題尚無(wú)明確定論，給中藥質(zhì)量控制和監(jiān)管帶來(lái)很大的考驗(yàn)。

今年3月，國(guó)家藥監(jiān)局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家林業(yè)和草原局、國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)布的《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》明確，禁用人工干預(yù)產(chǎn)生的多倍體或者單倍體品種、種間雜交品種和轉(zhuǎn)基因品種。由于種間雜交品種同時(shí)具備母本和父本的遺傳特征，短片段的DNA條形碼及細(xì)胞器基因組的“超級(jí)條形碼”無(wú)法滿(mǎn)足針對(duì)這類(lèi)復(fù)雜品種的鑒定需求。為保證中藥材種質(zhì)的純正性，降低不確定種質(zhì)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，建立有效的鑒定方法十分必要。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量物種的基因組數(shù)據(jù)也在不斷公布更新，但對(duì)于一些基因組偏大、雜合率較高、重復(fù)序列頗多、倍性較復(fù)雜的中藥材物種來(lái)說(shuō)，全基因組測(cè)序技術(shù)成本太高。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，即利用限制性?xún)?nèi)切酶打斷基因組DNA，對(duì)特定片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從而獲得海量遺傳多態(tài)性標(biāo)簽序列，以充分代表目標(biāo)物種全基因組信息的策略，為我們從全基因組層面解決雜交品種鑒定問(wèn)題提供了新思路。

中華草龜（習(xí)稱(chēng)烏龜）是中藥材龜甲、龜甲膠的唯一法定來(lái)源，市場(chǎng)需求量較大。由于烏龜性成熟期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢，水產(chǎn)養(yǎng)殖成效受到限制，市場(chǎng)上烏龜偽品、混淆品充斥。中華花龜（習(xí)稱(chēng)花龜）生長(zhǎng)速度較快，但生態(tài)位窄，因此環(huán)境適應(yīng)性較差，其大范圍養(yǎng)殖同樣受到限制。人工培育的父本烏龜與母本花龜?shù)碾s交品種——花雜草龜充斥市場(chǎng)，給中藥飲片市場(chǎng)監(jiān)管帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。由于花雜草龜同時(shí)保留了親本龜?shù)闹虚g表型特征和基因型，使得傳統(tǒng)性狀鑒別方法以及常用分子鑒別方法均無(wú)法對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。研究團(tuán)隊(duì)利用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了首個(gè)烏龜簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)以及花龜重測(cè)序基因組文庫(kù)，獲得高質(zhì)量SNP標(biāo)記 88087個(gè)，設(shè)計(jì)了用于雜交品種花雜草龜鑒定的通用引物，開(kāi)發(fā)了“特異條形碼”，并起草了補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，有效解決了針對(duì)雜交龜甲充斥市場(chǎng)的監(jiān)管技術(shù)難題。

經(jīng)過(guò)10余年的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)在中藥鑒定領(lǐng)域的研究和應(yīng)用更加廣泛和深入。從單序列及其組合，到細(xì)胞器基因組的“超級(jí)條形碼”，再到基于全基因組遺傳多樣性信息開(kāi)發(fā)的“特異條形碼”，DNA條形碼技術(shù)助力中藥材現(xiàn)代鑒定技術(shù)研究和應(yīng)用發(fā)展，并成為避免中藥材市場(chǎng)陷入“劣幣驅(qū)逐良幣”惡性循環(huán)的有效手段。

此外，研究團(tuán)隊(duì)依據(jù)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)藥典收錄的草藥物種，完成全球藥典草藥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)并上線(xiàn)。該數(shù)據(jù)庫(kù)依據(jù)中國(guó)藥典、美國(guó)草藥典、日本藥局方、韓國(guó)藥典、印度藥典、埃及藥典、歐洲藥典以及巴西藥典等，收錄903個(gè)草藥物種的34346條數(shù)據(jù)，包括867個(gè)物種的21872條DNA條形碼數(shù)據(jù)，674個(gè)物種的2000余個(gè)細(xì)胞器基因組及核基因組數(shù)據(jù)等。該數(shù)據(jù)庫(kù)是全球首個(gè)針對(duì)藥典收載草藥物種的大型基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，將為草藥物種鑒定、用藥安全等提供信息支撐。今年1月，該數(shù)據(jù)庫(kù)研究入選了中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的“2021年度中醫(yī)藥十大學(xué)術(shù)進(jìn)展”。

然而，目前DNA條形碼技術(shù)在藥檢系統(tǒng)中的應(yīng)用還有待深入推廣，相關(guān)檢驗(yàn)業(yè)務(wù)開(kāi)展較少，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂和執(zhí)行仍有待推進(jìn)。如何使現(xiàn)代中藥鑒定技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥檢定工作，如同理化檢驗(yàn)、色譜技術(shù)等在中藥質(zhì)量控制及監(jiān)督檢驗(yàn)中得到普及一般，是當(dāng)下需要思考和摸索的問(wèn)題。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，可以從以下幾個(gè)方面入手。一是加快適應(yīng)中藥日常檢定工作的法定中藥DNA條形碼信息數(shù)據(jù)庫(kù)完善及相關(guān)鑒定軟件的開(kāi)發(fā)。二是加強(qiáng)多學(xué)科、多技術(shù)方法的融合，推動(dòng)中藥材DNA條形碼技術(shù)自動(dòng)化研發(fā)進(jìn)程。三是推動(dòng)地方標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)具體物種的DNA條形碼鑒定研究及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定工作的開(kāi)展，推廣中藥材DNA條形碼技術(shù)在中藥監(jiān)管中的應(yīng)用。

中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展必須依靠科學(xué)和技術(shù)，只有推動(dòng)原創(chuàng)性技術(shù)的研究應(yīng)用才能更好地助力中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展。未來(lái)，中藥材DNA條形碼技術(shù)將會(huì)越來(lái)越多地參與到中藥材質(zhì)量控制研究中，更好適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的需要，推動(dòng)中藥材質(zhì)量控制水平邁上新臺(tái)階。